近年來，由于細(xì)胞治療方法的興起，人們?nèi)找嫘枨竽軌蚋哔|(zhì)量、穩(wěn)健、有效進行細(xì)胞表征測定的方法。細(xì)胞計數(shù)，作為細(xì)胞療法中基礎(chǔ)的檢測項目，現(xiàn)今需要更高的檢測可信度。那么，細(xì)胞計數(shù)方法在上有標(biāo)準(zhǔn)嗎？2017年4月，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）&食品與藥物管理局（FDA）共同舉辦了一場專注于細(xì)胞計數(shù)的研討會，聚焦于選擇、設(shè)計和驗證細(xì)胞計數(shù)方法，以及如何得到充分的計量保證。近50位來自于工業(yè)界、學(xué)術(shù)界和政府監(jiān)管機構(gòu)的專家參與了研討會。Nexcelom Bioscience作為為數(shù)不多的受邀細(xì)胞計數(shù)設(shè)備制造商之一列席參加了本次會議，與業(yè)界專家們共同討論細(xì)胞治療中關(guān)于細(xì)胞計數(shù)的各種問題。本文總結(jié)了此次會議的討論重點。（文末點擊“閱讀原文”下載英文全文）

研討會的總體主題：我們需要根據(jù)細(xì)胞樣品的屬性，細(xì)胞計數(shù)的目的和要求，來選擇適合目的（fit-for purpose）的測量方法。例如，藥物篩選和細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)與放行過程中的細(xì)胞計數(shù)要求會有顯著不同。Fit-for purpose是指選擇的方法是否適合細(xì)胞計數(shù)的預(yù)期目的。理想的適用性需要滿足兩方面的要求，一是能解決生物學(xué)問題，二是獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量（靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度）足夠好，足以支持下游決策。一個更標(biāo)準(zhǔn)化的設(shè)計、限定和驗證符合fit-for purpose原則的細(xì)胞計數(shù)方法的流程，將加速產(chǎn)品的開發(fā)和轉(zhuǎn)化。

研討會上討論的主要內(nèi)容：

細(xì)胞計數(shù)測量過程

細(xì)胞計數(shù)遵循相同的常規(guī)步驟：（i）樣品準(zhǔn)備，（ii）手工計數(shù)或使用儀器設(shè)備的自動計數(shù)，（iii）數(shù)據(jù)分析（如圖1）。

測量過程中的很多方面都可能給結(jié)果帶來顯著的可變性。此外作為測量過程中“輸入”的細(xì)胞樣品，屬性可能會有大范圍的波動，也會給計數(shù)結(jié)果帶來顯著的可變性。細(xì)胞樣品本身就很復(fù)雜，具有一系列穩(wěn)定或者變化的性質(zhì) - 樣品配方（如培養(yǎng)基組分）、成分（如不同細(xì)胞類型和功能）和固有的生物學(xué)可變性（如供體變化和細(xì)胞狀態(tài)）。認(rèn)識到細(xì)胞計數(shù)過程和細(xì)胞樣品相關(guān)的各種影響因素，研討會上專家們討論了提高細(xì)胞計數(shù)可信度的策略。

從監(jiān)管角角度看細(xì)胞計數(shù)

FDA的與會人員強調(diào)了細(xì)胞計數(shù)對于檢測細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量（如屬性、純度、效價和劑量）的重要性。他們重申基于不同目的，細(xì)胞計數(shù)方法可能不同，這主要取決于細(xì)胞治療產(chǎn)品本身。他們進一步指出，雖然在獲得許可證之前，細(xì)胞計數(shù)等試驗方法不需要進行驗證；但越早建立高可信度的方法，越有利于產(chǎn)品轉(zhuǎn)化（圖2）。FDA與會人員特別指出：確定適當(dāng)?shù)募?xì)胞計數(shù)方法，了解可用的儀器，有助于共識性文件標(biāo)準(zhǔn)的制定和參考樣品的開發(fā)，有利于解決再生醫(yī)學(xué)療法中細(xì)胞計數(shù)方面的挑戰(zhàn)。

建立細(xì)胞計數(shù)方面的質(zhì)量屬性

細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量屬性可通過測定相關(guān)的、可測量的生物學(xué)指標(biāo)來評估。許多質(zhì)量屬性直接（如總細(xì)胞濃度、活細(xì)胞濃度）或間接（如使用細(xì)胞濃度歸一化處理的活力數(shù)據(jù)）使用細(xì)胞計數(shù)結(jié)果獲得數(shù)據(jù)。選擇細(xì)胞計數(shù)方法時，要明確理解測量對象和預(yù)期質(zhì)量屬性之間的關(guān)系（如活細(xì)胞濃度、存活率百分比）。

例如活細(xì)胞濃度是一種差異細(xì)胞計數(shù)，需要將活細(xì)胞與死細(xì)胞區(qū)分開，與細(xì)胞類型無關(guān)?；罴?xì)胞濃度又可以進一步分解成兩個屬性組成：活細(xì)胞數(shù)和樣品體積。

測定活細(xì)胞數(shù)時，很多生物學(xué)指標(biāo)可以用來區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。這些生物學(xué)指標(biāo)包括細(xì)胞膜完整性、代謝活力和細(xì)胞復(fù)制能力。生物學(xué)指標(biāo)可以通過不同測試方法測定，且每種測試方法都有不同的測量對象。例如臺盼藍(lán)排除和PI核酸染色法都可以通過測試細(xì)胞膜完整性來區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。對同一個生物學(xué)指標(biāo)的類似檢測，不同染料（大小、親和力不同）對細(xì)胞膜滲透性的固有不同和顯示信號（比色或者熒光）的不同，也會導(dǎo)致結(jié)果上的差異。

另一個屬性組成是樣品的體積。體積可以通過校準(zhǔn)過的儀器來獲得（例如已測定的計數(shù)室尺寸）：間接方法如同時用基于流式原理的方法測定已知濃度的微珠；或者通過流量計等方法直接測定。體積測定偏差將導(dǎo)致結(jié)果偏差，降低活細(xì)胞濃度測定結(jié)果精密度。另外在測試活細(xì)胞濃度時，儀器與儀器之間結(jié)果的差異，有些情況下可能是因為儀器體積校準(zhǔn)之間的差異造成的。

總的來說，應(yīng)選擇反映預(yù)期測量目的的生物學(xué)指標(biāo)；當(dāng)應(yīng)用這些生物學(xué)指標(biāo)時，能夠反映細(xì)胞治療產(chǎn)品的作用機理。此外，測量目標(biāo)應(yīng)盡可能與生物學(xué)指標(biāo)直接相關(guān)。專家強調(diào)需要了解細(xì)胞計數(shù)的生物學(xué)基礎(chǔ)，特別是當(dāng)某個細(xì)胞亞群被認(rèn)為與生物學(xué)或臨床結(jié)果相關(guān)時的差異細(xì)胞計數(shù)。

選擇與設(shè)計細(xì)胞計數(shù)方法

自18世紀(jì)以來，使用血球計數(shù)板進行手工計數(shù)一直被認(rèn)為是細(xì)胞計數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。研討會的參會人員表示這種觀點現(xiàn)在依然存在。手工計數(shù)非常費時，并且誤差很大，會給產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)帶來很多問題。隨著技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在許多基于自動成像和流式原理的方法被用來進行總細(xì)胞和亞細(xì)胞群計數(shù)?？蛇x的方法很多，樣品類型以及細(xì)胞計數(shù)目的也各不相同。

細(xì)胞計數(shù)檢測過程的考慮因素大致上可以分為：（i）生物學(xué)相關(guān)因素；（ii）測量特性相關(guān)因素，包括計量保證策略；（iii）合規(guī)性及其他實際因素。生物學(xué)相關(guān)因素是指計數(shù)方法基于生物學(xué)指標(biāo)獲得細(xì)胞數(shù)量的能力。分析方法的測量特性相關(guān)因素包括計數(shù)方法提供足夠特異、精密和穩(wěn)健數(shù)據(jù)的能力；控制測量過程中的可變性并確保從中的可信度的能力也是需要的；另一個需要重點考慮的因素是方法在產(chǎn)品研發(fā)管線各個環(huán)節(jié)中的轉(zhuǎn)化能力。理想情況下，研發(fā)過程中使用的細(xì)胞計數(shù)方法應(yīng)該能夠應(yīng)用到生產(chǎn)甚至放行中。細(xì)胞計數(shù)系統(tǒng)需要盡量少的可變因素和校準(zhǔn)要求，內(nèi)置自控系統(tǒng)。緊接下來需要考慮的就是合規(guī)性，包括是否滿足GMP （Good Manufacturing Practice）要求。如果不止使用一種計數(shù)方法，或者在不同地點使用同一種方法，需要考慮方法之間的可比性。其他需要考慮的實際因素包括：用量、價格、所需時間以及培訓(xùn)。一個特別需要指出的挑戰(zhàn)是計數(shù)方法能夠允許使用者自行修改調(diào)整的程度。儀器提供越多的微調(diào)設(shè)置，將提供更大的靈活性和可優(yōu)化性；另一方面，增加儀器的靈活性意味著需要更多的培訓(xùn)，以及在生產(chǎn)中做更多記錄。

實驗設(shè)計（DOE）在優(yōu)化細(xì)胞計數(shù)流程中的應(yīng)用

一旦細(xì)胞計數(shù)的目的和大致方法已經(jīng)確定，建議使用“實驗設(shè)計（Design of Experiments ，DOE）來進行方法優(yōu)化和穩(wěn)健性測試。

專家指出很多因素影響了細(xì)胞計數(shù)實驗。這些因素包括準(zhǔn)備細(xì)胞樣品時使用的稀釋液。稀釋液可能影響樣品的穩(wěn)定性，引入或者減少影響計數(shù)的碎片或雜質(zhì)。儀器與儀器之間的差異也是一個挑戰(zhàn)，需要使用更穩(wěn)健的體積校準(zhǔn)策略來改進，例如使用已知濃度的微珠或其他體積校準(zhǔn)方法。很多因素會影響細(xì)胞計數(shù)方法，精心設(shè)計的DOE有助于理解每個因素的作用以及各個因素在細(xì)胞計數(shù)過程中的聯(lián)系。

細(xì)胞計數(shù)驗證

基于現(xiàn)有的經(jīng)驗，很多參會者推薦了人類用藥物技術(shù)要求協(xié)調(diào)理事會（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）的指南：“Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) for Validation of Analytical Methods”【1】用于細(xì)胞計數(shù)方法驗證。ICH傳統(tǒng)上專注于藥物制造，而不是細(xì)胞治療產(chǎn)品。指南中描述了準(zhǔn)確度、精密度、特異性、檢測限、定量限、線性、范圍和穩(wěn)健性的概念。這個通用的驗證框架在很大程度上適用于細(xì)胞的分析測量，但對于細(xì)胞治療產(chǎn)品要做出一些針對性的調(diào)整。

受限于動態(tài)、復(fù)雜，有時數(shù)量還有限的樣品，需要對驗證步驟進行改變，或者增加額外的考量。例如在考察細(xì)胞計數(shù)中間精密度（不同操作者、不同儀器、不同日期、不同批次之間的差異）時，實驗設(shè)計時需要考慮整個周期中樣品的穩(wěn)定性，尤其需要考慮可能影響細(xì)胞計數(shù)的樣品性質(zhì)（如細(xì)胞活率、細(xì)胞聚集、碎片和氣泡形成等）。

準(zhǔn)確度對細(xì)胞計數(shù)來說，是個*的挑戰(zhàn)。理想的細(xì)胞計數(shù)計數(shù)結(jié)果應(yīng)該既精密又準(zhǔn)確。細(xì)胞計數(shù)的精密度可以通過實驗確定。但因為缺少合適的參考樣品和對照方法，細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確度很難獲得。

評估準(zhǔn)確度一般是通過對比測定結(jié)果與具有參考值和已知不確定性的恰當(dāng)參考樣品的檢測結(jié)果，或者通過與對照方法進行比較。因為細(xì)胞計數(shù)測定缺少通用的參考樣品，基于人工顯微鏡觀察計數(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”也具有很大的偏差和不精密性，通過上述方法檢測準(zhǔn)確度不能滿足細(xì)胞治療產(chǎn)品對準(zhǔn)確度的要求。

為了滿足工業(yè)界的需要，NIST近期開發(fā)出了在沒有合適對照方法和樣品的情況下，評估細(xì)胞計數(shù)方法的策略。這些方法通過系列稀釋試驗設(shè)計，評估了細(xì)胞計數(shù)方法的精密度和比例性。在這樣的實驗設(shè)計中，細(xì)胞計數(shù)結(jié)果對梯度稀釋的比例響應(yīng)作為評價計數(shù)質(zhì)量的內(nèi)部基準(zhǔn)【2】。這個過程不受測定方法和細(xì)胞類型的影響，提供了一種不依賴于“金標(biāo)準(zhǔn)”方法或參考樣品比較，就可以評估細(xì)胞計數(shù)方法質(zhì)量的途徑。這個策略的目標(biāo)就是解決細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)者在細(xì)胞計數(shù)方法轉(zhuǎn)型或者選擇“fit for purpose”計數(shù)方法時遇到的挑戰(zhàn)。

細(xì)胞計數(shù)的生物或非生物參考樣品及內(nèi)參

合適的參考樣品將有助于對細(xì)胞計數(shù)準(zhǔn)確度的評估，有利于對細(xì)胞計數(shù)方法之間進行比較。因此，研討會討論中很重要的一部分就集中在現(xiàn)今細(xì)胞計數(shù)參考樣品的使用和參考樣品的需求上。會上達成了一個重要共識：使用者需要理解各種參考樣品在計數(shù)過程中的作用。細(xì)胞治療從業(yè)者需要優(yōu)化的或者新的參考樣品來評估細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確度。會上討論了生物的（基于細(xì)胞）和非生物的（主要是微珠）參考樣品的作用。有人指出針對測定過程的特定方面需要選擇合適的參考樣品，且不應(yīng)在其預(yù)期使用目的之外進行過度解讀。

細(xì)胞計數(shù)計量保證策略

為了保證測量結(jié)果的質(zhì)量，需要使用基于計量科學(xué)原則的計量保證策略。理想的測量結(jié)果由以下3點構(gòu)成：（i）以常用單位表示的數(shù)值，（ii）測量不確定度，（iii）可以保證測量結(jié)果質(zhì)量的證據(jù)。對細(xì)胞計數(shù)來說，了解測量過程是否會以及何時會達不到標(biāo)準(zhǔn)很重要。在這種情況下，需要設(shè)計計量保證策略以提供足夠的證據(jù)來監(jiān)測測量過程的質(zhì)量，提供計數(shù)結(jié)果是否可靠的指示。測量保證的證據(jù)通常以測量過程中的中間測量形式出現(xiàn)，在整個測量過程中的特定點建立可信度。測量保證策略可以每年或每季度不定期實施，通過驗證和SOP作為質(zhì)量保證計劃的一部分。儀器驗證步驟等其他策略可以為每天的測量提供保證；或者與每次測量同時進行，以提供每個測量值的可信度。



當(dāng)計量保證策略應(yīng)用到每次測量中時，它們作為測量步驟中的控制環(huán)節(jié)，為測量過程提供同時驗證。這種策略在長期記錄和監(jiān)測一種分析方法時非常有效，并能夠識別方法中的偏移和錯誤。很多測量步驟中的控制環(huán)節(jié)可以直接使用細(xì)胞計數(shù)的數(shù)據(jù)，或者通過使用測試樣品即可進行的簡單實驗來完成。這樣的設(shè)計策略具有實際可操作性。例如，細(xì)胞計數(shù)結(jié)果是單位體積的細(xì)胞數(shù)；在使用細(xì)胞計數(shù)值做出決策之前我們有幾個假設(shè)。這些假設(shè)包括：（i）細(xì)胞是懸浮于介質(zhì)中的單個物體，（ii）所有目標(biāo)細(xì)胞都被計數(shù)了，而其他的都被排除了，（iii）已知體積已經(jīng)被驗證過，（iv）試劑和儀器工作正常，（v）檢測結(jié)果在線性范圍內(nèi)，在檢出限以上，在飽和限以下。在測量時需要收集證明以上假設(shè)是可信的證據(jù)。例如，需要設(shè)置對照試驗和數(shù)據(jù)分析策略，在試劑出現(xiàn)問題、細(xì)胞過度聚集、流路堵塞、儀器狀態(tài)改變或預(yù)設(shè)體積錯誤時提醒使用者。當(dāng)設(shè)置了合適的測量步驟中的控制環(huán)節(jié)，細(xì)胞計數(shù)測定過程的質(zhì)量才能獲得保證（圖4）。

總結(jié)

本次細(xì)胞計數(shù)研討會的一個關(guān)鍵結(jié)論就是：獲得高質(zhì)量細(xì)胞計數(shù)結(jié)果的方法并不是單一的。使用者必須要考慮細(xì)胞計數(shù)的目的，設(shè)計合適的方法和計量保證策略。人們需要開發(fā)、鑒定和驗證細(xì)胞計數(shù)方法的通用策略和原則，這些前期的努力會決定后期標(biāo)準(zhǔn)化的考慮和努力方向。關(guān)于細(xì)胞計數(shù)的建議包括：（i）文件標(biāo)準(zhǔn)實踐指南，（ii）一致的術(shù)語，以實現(xiàn)共同理解和清晰的溝通，（iii）生物以及非生物參考樣品以提升計量保證，（iv）有別于“one-size fits all”觀念的，基于“fit-for-purpose”原則的個體化檢測策略。

Nexcelom Bioscience 作為受邀細(xì)胞計數(shù)設(shè)備供應(yīng)商之一參與了本次研討會，與多位同行、細(xì)胞治療從業(yè)者及政策法規(guī)制定者進行了廣泛的交流和討論，也更加深入地了解了行業(yè)所面臨的挑戰(zhàn)以及業(yè)界對相關(guān)設(shè)備制造商的期望。作為細(xì)胞計數(shù)領(lǐng)域的，Nexcelom責(zé)無旁貸，會一如既往地以技術(shù)創(chuàng)新為驅(qū)動力，打造基于用戶需求的產(chǎn)品，為細(xì)胞治療產(chǎn)業(yè)和人類健康事業(yè)的發(fā)展貢獻應(yīng)有的力量！

參考文獻

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