細胞凋亡是一種正常的生理過程，發(fā)生在胚胎發(fā)育過程中以及組織穩(wěn)態(tài)的維持過程中。細胞凋亡程序的特征在于某些形態(tài)學特征，包括質(zhì)膜不對稱性和附著的喪失、細胞質(zhì)和細胞核的濃縮以及 DNA 的核小體間裂解。質(zhì)膜缺失是最早的特征之一。在凋亡細胞中，膜磷脂磷脂酰絲氨酸 (PS) 從質(zhì)膜的內(nèi)部轉(zhuǎn)移到外部小葉，從而將 PS 暴露于外部細胞環(huán)境。Annexin V 是一種 35-36 kDa Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對 PS 具有高親和力，并與暴露的 PS 細胞結(jié)合。Annexin V 可以與包括 FITC 在內(nèi)的熒光染料結(jié)合。這種形式保留了其對 PS 的高親和力，因此可作為對正在發(fā)生凋亡的細胞進行流式細胞術(shù)分析的靈敏探針。由于 PS 的外化發(fā)生在細胞凋亡的早期階段，因此 FITC Annexin V 染色可以比基于核變化（如 DNA 片段化）的檢測更早地識別細胞凋亡。
FITC Annexin V 染色發(fā)生在膜完整性喪失之前，伴隨著細胞凋亡或壞死過程導致的細胞死亡的新階段。因此，F(xiàn)ITC Annexin V 染色通常與活性染料（如碘化丙啶 (PI) 或 7-氨基放線菌素 (7-AAD)）結(jié)合使用，使研究人員能夠識別早期凋亡細胞（PI 陰性，F(xiàn)ITC Annexin V積極的）。具有完整膜的活細胞排除 PI，而死亡和受損細胞的膜可滲透 PI。例如，被認為有活力的細胞是 FITC Annexin V 和 PI 陰性；早期凋亡細胞FITC Annexin V陽性，PI陰性；凋亡晚期或已經(jīng)死亡的細胞FITC Annexin V和PI均為陽性。該測定不區(qū)分經(jīng)歷凋亡死亡的細胞與因壞死途徑死亡的細胞，因為在任何一種情況下，死細胞都會被 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 和 PI 染色。然而，當隨著時間的推移測量細胞凋亡時，通?？梢宰粉櫦毎麖?FITC Annexin V 和 PI 陰性（有活力或不可測量的細胞凋亡），到 FITC Annexin V 陽性和 PI 陰性（早期細胞凋亡，存在膜完整性），最后到FITC Annexin V 和 PI 陽性（終末期細胞凋亡和死亡）。細胞通過這三個階段的運動表明細胞凋亡。相比之下，表明細胞同時為 FITC Annexin V 和 PI 陽性的單一觀察結(jié)果本身揭示的關于細胞死亡過程的信息較少。死細胞會被 FITC Annexin V 和 PI 染色。然而，當隨著時間的推移測量細胞凋亡時，通常可以追蹤細胞從 FITC Annexin V 和 PI 陰性（有活力或不可測量的細胞凋亡），到 FITC Annexin V 陽性和 PI 陰性（早期細胞凋亡，存在膜完整性），最后到FITC Annexin V 和 PI 陽性（終末期細胞凋亡和死亡）。細胞通過這三個階段的運動表明細胞凋亡。相比之下，表明細胞同時為 FITC Annexin V 和 PI 陽性的單一觀察結(jié)果本身揭示的關于細胞死亡過程的信息較少。死細胞會被 FITC Annexin V 和 PI 染色。然而，當隨著時間的推移測量細胞凋亡時，通?？梢宰粉櫦毎麖?FITC Annexin V 和 PI 陰性（有活力或不可測量的細胞凋亡），到 FITC Annexin V 陽性和 PI 陰性（早期細胞凋亡，存在膜完整性），最后到FITC Annexin V 和 PI 陽性（終末期細胞凋亡和死亡）。細胞通過這三個階段的運動表明細胞凋亡。相比之下，表明細胞同時為 FITC Annexin V 和 PI 陽性的單一觀察結(jié)果本身揭示的關于細胞死亡過程的信息較少。存在膜完整性），最后變?yōu)?FITC Annexin V 和 PI 陽性（終末期細胞凋亡和死亡）。細胞通過這三個階段的運動表明細胞凋亡。相比之下，表明細胞同時為 FITC Annexin V 和 PI 陽性的單一觀察結(jié)果本身揭示的關于細胞死亡過程的信息較少。存在膜完整性），最后變?yōu)?FITC Annexin V 和 PI 陽性（終末期細胞凋亡和死亡）。細胞通過這三個階段的運動表明細胞凋亡。相比之下，表明細胞同時為 FITC Annexin V 和 PI 陽性的單一觀察結(jié)果本身揭示的關于細胞死亡過程的信息較少。
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FITC Annexin V 是一種用于識別凋亡細胞的靈敏探針，與帶負電荷的磷脂表面結(jié)合（Kd 約為 5 x 10^-2），對磷脂酰絲氨酸 (PS) 的親和力高于大多數(shù)其他磷脂。FITC Annexin V 結(jié)合是鈣依賴性的，如 FITC Annexin V 染色方案中所述，最佳染色需要確定的鈣和鹽濃度。 研究人員應注意，F(xiàn)ITC Annexin V 對貼壁細胞類型（例如 HeLa、NIH 3T3 等）的流式細胞術(shù)分析并非常規(guī)測試，因為在細胞分離或收獲過程中可能會發(fā)生特定的膜損傷。然而，之前已經(jīng)報道了利用膜聯(lián)蛋白 V 對貼壁細胞類型進行流式細胞術(shù)的方法（Casiola-Rosen 等人和 van Engelend 等人）。
喜樹堿誘導細胞凋亡
提供以下協(xié)議作為說明如何在細胞系 (Jurkat) 上使用 FITC 膜聯(lián)蛋白 V。
材料
1. 制備喜樹堿儲備液（Sigma-Aldrich 目錄號 C-9911）：1 mM DMSO 溶液。
2. Jurkat T 細胞 (ATCC TIB-152)。
程序
1. 將喜樹堿（最終濃度 4-6 µM）添加到 1 x 10^6 Jurkat 細胞中。
2. 在 37°C 下孵育細胞 4-6 小時。
3. 繼續(xù)使用 FITC Annexin V 染色方案來測量細胞凋亡。
FITC 附聯(lián)蛋白 V 染色方案
FITC Annexin V 用于定量確定細胞群中正在積極經(jīng)歷凋亡的細胞百分比。它依賴于細胞在細胞凋亡的早期階段失去膜不對稱性的特性。在凋亡細胞中，膜磷脂磷脂酰絲氨酸 (PS) 從質(zhì)膜的內(nèi)葉轉(zhuǎn)移到外葉，從而將 PS 暴露于外部環(huán)境。Annexin V 是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對 PS 具有高親和力，可用于鑒定暴露于 PS 的凋亡細胞。碘化丙啶 (PI) 是一種標準的流式細胞儀活性探針，用于區(qū)分活細胞和非活細胞。具有完整膜的活細胞排除 PI，而死細胞和受損細胞的膜可滲透 PI。FITC Annexin V 染色呈陽性而 PI 呈陰性的細胞正在發(fā)生凋亡。FITC Annexin V 和 PI 染色呈陽性的細胞要么處于細胞凋亡的末期，要么正在發(fā)生壞死，要么已經(jīng)死亡。FITC Annexin V 和 PI 染色均為陰性的細胞是活的，沒有發(fā)生可測量的細胞凋亡。
試劑
1. FITC Annexin V（成分編號 51-65874X）：每次測試使用 5 µl。
2. 碘化丙啶 (PI)（組分編號 51-66211E）是一種方便的即用型核酸染料。每次測試使用 5 µl。
3. 10X 膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合緩沖液（組分號 51-66121E）：0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4)、1.4 M NaCl、25 mM CaCl2。對于 1X 工作溶液，將 1 份 10X 膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合緩沖液稀釋至 9 份蒸餾水。
染色
1. 用冷 PBS 洗滌細胞兩次，然后以 1 x 10^6 個細胞/ml 的濃度在 1X 結(jié)合緩沖液中重懸細胞。
2. 將 100 µl 溶液（1 x 10^5 個細胞）轉(zhuǎn)移到 5 ml 培養(yǎng)管中。
3. 加入 5 µl FITC Annexin V 和 5 µl PI。
4. 輕輕渦旋細胞并在室溫 (25°C) 黑暗中孵育 15 分鐘。
5. 向每管中加入 400 µl 1X 結(jié)合緩沖液。在 1 小時內(nèi)通過流式細胞儀進行分析。
設置流式細胞術(shù)的建議控制
以下控件用于設置薪酬和象限：
1. 未染色的細胞。
2. 用 FITC Annexin V（無 PI）染色的細胞。
3. 用 PI 染色的細胞（無 FITC Annexin V）。
其他染色對照：
應使用易于誘導細胞凋亡的細胞系來獲得 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 和/或 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 和 PI 的陽性對照染色。重要的是要注意細胞凋亡和壞死的基礎水平在人群中有很大差異。因此，即使在沒有誘導細胞凋亡的情況下，大多數(shù)細胞群也會包含一小部分細胞凋亡陽性（FITC Annexin V 陽性，PI 陰性或 FITC Annexin V 陽性，PI 陽性）。
未處理的群體用于定義凋亡和死細胞的基礎水平。然后通過從處理過的細胞群中凋亡細胞的百分比中減去未處理過的細胞群中凋亡細胞的百分比來確定已經(jīng)被誘導經(jīng)歷細胞凋亡的細胞的百分比。由于細胞死亡是細胞經(jīng)歷凋亡的最終結(jié)果，處于凋亡后期的細胞將有受損的細胞膜，并且 PI 和 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 染色呈陽性。因此，該測定無法區(qū)分已經(jīng)經(jīng)歷過凋亡的細胞凋亡細胞死亡和那些因壞死途徑而死亡的細胞，因為在任何一種情況下，死細胞都會被 FITC Annexin V 和 PI 染色。
準備和存儲
在 4°C 下未經(jīng)稀釋儲存，并避免長時間暴露在光線下。不要凍結(jié)。
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