L6大鼠成肌細(xì)胞

一．貼壁細(xì)胞  
客戶接收到細(xì)胞，用75%的酒精消毒（建議配制75%酒精的水是滅菌過的）培養(yǎng)瓶外部。
肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞100X ,200X 各一張）。
顯微鏡觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融匯至80%左右（可以傳代的情況下），細(xì)胞應(yīng)該在37度培養(yǎng)箱預(yù)溫1-2h后再做處理。如未達(dá)到細(xì)胞傳代密度，培養(yǎng)瓶應(yīng)預(yù)留一部分培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴(yán)禁直接傾倒），放入另一無菌容器中（建議換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞）。
用PBS 2-3ml/次輕輕洗細(xì)胞表面，加入適量的0.05%胰酶-EDTA消化細(xì)胞,顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，輕輕拍打培養(yǎng)瓶直到細(xì)胞脫落，加入終止液終止。 
1000rpm,5min離心，重懸細(xì)胞。換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃,5%CO2  培養(yǎng)。 
二．懸浮細(xì)胞 
1. 接收到細(xì)胞，用75%的酒精消毒（建議配制75%酒精的水是滅菌過的）培養(yǎng)瓶外部。
2. 肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞100X ,200X 各一張）。
3. 嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4. 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴(yán)禁直接傾倒）。
5. 1000rpm,5min離心，重懸細(xì)胞。 換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶和新鮮培養(yǎng)基，37℃,5%CO2  培養(yǎng)。
三．一毫升小管操作方法  小管內(nèi)也是此細(xì)胞。 
1. 用75%的酒精消毒（建議配制75%酒精的水是滅菌過的）。
2. 嚴(yán)格無菌操作，用吸管吸出管中細(xì)胞至9ml*培養(yǎng)基混勻。
3. 1000rpm,5min離心，重懸細(xì)胞。 
4.換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃,5%CO7  培養(yǎng)。

L6大鼠成肌細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)三不要：
養(yǎng)科研細(xì)胞是生物醫(yī)學(xué)研究的基本功。有三個(gè)小經(jīng)驗(yàn)可以和大家分享一下：
1. 不要燒瓶口。大多數(shù)人都喜歡在酒精燈的火焰上關(guān)瓶子，覺得這樣可以避免污染。不知道大家是不是有培養(yǎng)基怎么越用越發(fā)紫的困惑？知道為什么嗎？燒瓶口燒的。培養(yǎng)基一般都是用碳酸/碳酸氫跟作緩沖體系。瓶口在火焰上的時(shí)候，熾熱的空氣進(jìn)入瓶內(nèi)。塞緊塞子放入冰箱后，空氣變冷，壓力驟降，培養(yǎng)基中的碳酸就會(huì)轉(zhuǎn)化成二氧化碳，釋放出來。培養(yǎng)基中的碳酸少了，當(dāng)然會(huì)變堿。如果不燒瓶口的話，你會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變堿的速度會(huì)大大減慢。（當(dāng)然多多少少還是會(huì)有一點(diǎn)越用越堿，因?yàn)槭覝剡€是比冰箱內(nèi)的溫度高）
其實(shí)燒瓶口防止污染純粹是心理安慰。不妨試一下把手指在火上晃幾下，你會(huì)發(fā)現(xiàn)根本就不會(huì)燒疼。如果有細(xì)菌的話，這么晃兩下也燒不死多少。要想燒死全部細(xì)菌，除非把瓶口和塞子燒紅。我在國內(nèi)從來就不燒瓶口。來美國以后發(fā)現(xiàn)這里更*，超凈臺(tái)內(nèi)根本就不點(diǎn)酒精燈。
2. 不要頻繁看細(xì)胞。對(duì)于初學(xué)者而言，養(yǎng)細(xì)胞就像養(yǎng)孩子一樣，有空就要去看看。細(xì)胞越是養(yǎng)不好，就越是經(jīng)常去看。實(shí)際上看細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的生長沒有任何好處，細(xì)胞系特別是對(duì)原代細(xì)胞或是免疫磁珠分選后，密度特別低的細(xì)胞。培養(yǎng)基中的生長因子是非常有限的。細(xì)胞好不容易自分泌一點(diǎn)兒促生長的因子在其周圍，形成有利于生長的局部環(huán)境。你跑去看細(xì)胞，培養(yǎng)瓶這么一晃，把因子都給晃散了。經(jīng)?？梢钥吹叫率忠惶斓酵矶荚诳醇?xì)胞，細(xì)胞老是長不好。老手細(xì)胞一扔好幾天不管，細(xì)胞瘋長。
3. 不要怕消化。在傳代的時(shí)候，初學(xué)者往往生怕細(xì)胞消化過度，早早地終止消化。細(xì)胞沒下來就使勁吹燈，吹得滿瓶子都是氣泡。在我看來，用力吹打?qū)?xì)胞的損傷比消化更大。我?guī)熜衷谧鲅芷交≡臅r(shí)候，37度消化過夜，細(xì)胞也沒事。我一般是等細(xì)胞*變圓后才中止消化。細(xì)胞輕輕一晃就能下來。還有，動(dòng)作要輕柔，盡量不要產(chǎn)生氣泡。應(yīng)力相當(dāng)大，對(duì)細(xì)胞的傷害也是很大的。